LÍNEAS ACTUALES DE INVESTIGACIÓN

• CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD METABÓLICA Y FUNCIONAL DE BACTERIAS LÁCTICAS

  • Caracterización de actividades enzimáticas de bacterias probióticas relacionadas con su funcionalidad.
    
    

    La microbiota intestinal puede suministrar al hospedador cierta capacidad metabólica que falta en las células intestinales humanas, como la fermentación de compuestos no digeribles de la dieta, metanogénesis, gluconeogénesis, degradación de xenobióticos y biosíntesis de aminoácidos esenciales, vitaminas e isoprenoides. La fermentación de compuestos no digeribles de la dieta- prebióticos- por la microbiota intestinal, permite la recuperación y almacenamiento energético en forma de ácidos grasos de cadena corta, lo que provoca un descenso del pH, facilita la absorción de iones, y proporciona una fuente de energía directa para las células epiteliales. Además, la microbiota del colon puede degradar componentes no digeribles de la dieta liberando compuestos bioactivos, que sólo así pueden ser absorbidos y ejercer su efecto. En colaboración con otros grupos del instituto hemos estudiado la capacidad de utilización de lactulosa y derivados de lactulosa en forma de trisacáridos puros y de glicoconjugados proteicos por cepas de Lactobacillus, Streptococcus y Bifidobacterium observando que estos compuestos pueden ser utilizados cuando se encuentran como única fuente de carbono. También se ha demostrado la capacidad de bacterias probióticas de las especies L. plantarum, L. casei, L. acidophilus y B. lactis. de degradar algunos polifenoles de plantas como los antocianos debido a la presencia de actividad β-glucosidasa. Asimismo, los polifenoles del vino y particularmente los oligómeros con un grado polimerización medio y los flavanoles poliméricos (procianidinas), pueden modular la microbiota intestinal o ser metabolizados por ella como es el caso de L. plantarum IFPL 935 cepa de nuestra colección, que muestra una actividad propia de muy pocas especies intestinales.

    Degradación de flavan-3-oles por Lactobacillus plantarum IFPL935

    
    
    
  • Evaluación de ingredientes alimentarios (probióticos y prebióticos) potencialmente relacionados con el equilibrio intestinal
    
    

    Deteccción por PCR-DGGE de Lactobacillus plantarum IFPL935 durante su incubación con microbiota colónica

    Dado el especial interés que poseen algunas cepas de L. plantarum, como la mencionada IFPL935, el Grupo profundiza en el papel que esta cepa juega en el metabolismo colónico de potenciales compuestos bioactivos, añadiendo este lactobacilo a cultivos complejos representativos de la microbiota colónica y un extracto de vino tinto enriquecido en polifenoles. Se estudian los cambios que ocurren en los principales grupos de la microbiota colónica, y la actividad metabólica (ácidos grasos de cadena corta, amoníaco y catabolismo de polifenoles) que se desarrolla en presencia de IFPL935.

    
    
    
  • Microbiota colónica en condiciones de normobiosis y disbiosis asociada a obesidad
    
    

    La disbiosis observada en individuos con obesidad se caracteriza por una menor diversidad de microbiota intestinal, tanto en términos de grupos microbianos como de funcionalidad genética y se ha relacionado con un aumento de la permeabilidad intestinal producida por la grasa de la dieta, así como por determinadas respuestas inflamatorias y hormonales en el epitelio intestinal. Sin embargo, el estudio de los mecanismos de interacción entre la microbiota y la mucosa intestinal humana presenta limitaciones por el difícil acceso fisiológico a las regiones intestinales donde tienen lugar dichas interacciones. En esta línea de investigación el Grupo se centra en el estudio de las interacciones que tienen lugar entre la microbiota intestinal y el hospedador a través del desarrollo de simuladores gastrointestinales in vitro que operan en continuo y reproducen las condiciones fisiológicas del entorno intestinal humano. De esta forma, estudiamos la posible relación entre disbiosis de la microbiota intestinal, desórdenes metabólicos y trastornos del comportamiento.

    Simulador dinámico gastro intestinal

    
    
    
  • Herramientas moleculares para la detección, caracterización, identificación y expresión de caracteres funcionales de interés en bacterias lácticas.
    

    A lo largo de los años el Grupo ha generado una colección de bacterias lácticas compuesta por alrededor de 500 cepas que corresponden a los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y Enterococcus, aisladas en su mayoría de productos lácteos fermentados artesanales. Una parte importante de estas cepas se ha identificado por métodos moleculares fundamentalmente 16S- rDNA PCR y PCR cuantitativa y además, se ha caracterizado a nivel molecular en base a su sistema proteolítico, catabolismo de aminoácidos, desarrollo de aroma y producción de bacteriocinas.

    En la actualidad, uno de los objetivos del Grupo en esta línea es poder disponer de un sistema de identificación fiable que de manera rápida y con amplia capacidad de procesamiento pueda utilizarse para completar la identificación de la colección de microorganismos del CIAL. Para ello, se ha puesto a punto la identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF que identifica cepas a partir de sus perfiles de péptidos caracterizados por la masa molecular (m), la carga (z) y el ratio de masa/carga (m/z). Pero además, los estudios previos de caracterización de actividad antimicrobiana nos ha permitido ampliar la utilidad de la técnica MALDI-TOF para la clasificación de las cepas en función de la producción de bacteriocinas, habiendo sido posible mediante esta técnica rápida la diferenciación de cepas productoras de lacticina 3147 y nisina.

    
    

    Identificación de cepas de bacterias lácticas productoras de bacteriocinas

    Por otra parte, en colaboración con el Centro de Investigaciones Biológicas (CIB, CSIC) el Grupo ha desarrollado y patentado vectores de fusión transcripcional que permiten la detección de regiones promotoras uni- y bidireccionales en bacterias lácticas. Los vectores contienen como marcadores un gen mrfp sintético que codifica la proteína fluorescente roja mCherry (pTLR) y el gen gfp que codifica la proteína fluorescente verde GFP (pTLGR). Los plásmidos son de utilidad en la caracterización de regiones promotoras y para la expresión de genes divergentes. Estos vectores permiten estudiar en tiempo real las condiciones ambientales que intervienen en la regulación genética, así como los mecanismos de interacción entre bacterias.

    
    

    Emisión de fluorescencia roja y verde durante el crecimiento de bacterias que contienen el vector de fusión transcripcional pTLGR .

    
    
    

  LINEAS DE INVESTIGACIÓN CONSOLIDADAS EN LAS QUE EL GRUPO TIENE EXPERIENCIA

  • Caracterización del metabolismo de bacterias lácticas en relación con su aptitud tecnológica
    

    Desde la creación del Grupo se han realizado diversos estudios de caracterización del sistema proteolítico de bacterias lácticas y su aplicación en productos lácteos fermentados. Después de adquirir experiencia en el manejo de técnicas enzimáticas, nos especializamos en el estudio del metabolismo de bacterias lácticas, identificación de genes que codifican actividades enzimáticas de interés y caracterización de dichas actividades, con el fin de aplicarlas en la mejora de procesos tecnológicos como la maduración de quesos.

    Los estudios sobre catabolismo de aminoácidos y formación de aroma por bacterias lácticas se iniciaron con la concesión de un proyecto europeo en el que los miembros del consorcio fueron pioneros en esta temática en Europa. A este proyecto siguieron varios proyectos nacionales dirigidos a la potenciación del aroma mediante la inducción por agentes líticos. Uno de estos agentes, la bacteriocina lacticina 3147 producida por un lactococo de nuestra colección, posee actividad lítica sobre bacterias sensibles y fue objeto de numerosos estudios que incluyeron su completa caracterización molecular, su mecanismo de acción y la construcción de un transconjugante portador del plásmido que contiene los genes de la bacteriocina que se protegió bajo patente. Este lactococo es utilizable como cultivo iniciador para acelerar la maduración de quesos y como cultivo bioprotector para evitar el hinchamiento tardío de quesos semiduros provocado por Clostridium.
    

    
    

    Prevención del hinchamiento tardío del queso empleando L. lactis productor de lacticina 3147