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Flujo de trabajo en Metabolómica





workflow


Diseño del experimento

Cualquier estudio en Metabolómica comienza con un diseño adecuado del experimento de modo que los datos obtenidos tengan la suficiente relevancia y significancia estadística para llevar a cabo una interpretación biológica posterior adecuada. 

gota

Preparación de la muestra

Las matrices biológicas son muy complejas, por lo que se debe realizar un paso previo de preparación de la muestra antes de llevar a cabo el análisis. El tipo de extracción dependerá fundamentalmente del tipo de muestra biológica así como de las estructuras de los metabolitios que se pretendan analizar. Idealmente, en una estrategia metabolómica “no-dirigida”, el método de extracción no debe introducir sesgo en cuanto a las características químicas del conjunto de los metabolitos de un determinado sistema biológico.

Perfiles y huellas metabólicas

En Metabolómica se pueden seguir principalmente dos estrategias analíticas. Mientras la obtención de “perfiles metabólicos” se refiere al análisis de un grupo concreto de metabolitos (dentro de una misma familia o de una determinada ruta metabólica, por ejemplo), la obtención de “huellas metabólicas” hace referencia al análisis de todos los metabolitos de una determinada muestra. En este último caso la identidad de los metabolitos de interés se llevará a cabo después de un análisis estadístico de las huellas metabólicas.

binary

Data processing

Cuando el objetivo es la detección del mayor número de metabolitos posible en una muestra con una matriz compleja, y además, el número de muestras es elevado, el procesado previo de los datos crudos es muy importante. Los denominados “high throughput” análisis (o análisis de alto rendimento) de muestras biológicas dan lugar a una producción de datos masiva. De este modo, cualquier estudio metabolómico generará, especialmente cuando se empleen herramientas de detección automática de picos,  una gran matriz de datos con miles de variables (m/z, tiempo de retención, intensidad de pico). Las herramientas bioinformáticas desempeñan aquí un papel muy importante cuyo principal objetivo es el desarrollo de estategias útiles para la conversión de los datos en crudo obtenidos en el análisis en información útil. El análisis estadístico debe permitir la identificación de los metabolitos significativos (biomarcadores) que recojan el conjunto de variaciones al comparar los diferentes grupos de muestras.

Identificación de los metabolitos

Otro reto importante en Metabolómica es la identificación de los metabolitos de un modo automático. Hoy en día, muchos metabolitos de muestras biológicas no se encuentran en las bases de datos existentes. Debido a la falta de bases de datos completas y la complejidad química de muchos de los metabolitos, la obtención de espectros de masas exacta es fundamental para llevar a cabo una elucidación estructural fiable. Una masa exacta, proporciona, en el mejor de los casos, una fórmula molecular, no una estructura química. Para una mayor seguridad en la correcta identificación se necesitan experimentos adicionales de fragmentación iónica (MS/MS) así como de comparación de espectros MS obtenidos con estándares. La identificación tentativa de los metabolitos se lleva a cabo normalmente mediante comparación del valor de m/z experimentalmente obtenido con los valores m/z teóricos publicados en las bases de datos que en la actualidad están disponibles.

identification

Análisis de rutas metabólicas

Con el fin de completar el estudio metabolómico, se puede llevar a cabo el análisis de las rutas en las cuales están implicadas los metabolitos estadísticamente significativos. La identificación de la ruta metabólica alterada aporta información importante sobre los procesos bioquímicos alterados y sus posibles consecuencias a nivel molecular, creándose de este modo nuevas hipótesis dentro del estudio.

bioinformatics

Integración con otras “ómicas”

Con el fin de lograr una mayor comprensión de las funciones celulares en los diferentes niveles de expresión (genes, proteínas, metabolitos) y asociarlas a un fenotipo concreto, se necesita una aproximación integrativa  de los diferentes sets de datos para entender los principios que rigen la regulación de los genes, las proteínas y los metabolitos. Esta integración es un gran reto desde el punto de vista bioinformático debido a la gran cantidad de datos en cada uno de los niveles de expresión.